opscetningen fra de !i)vrige aktiviteter i laboratori–
et,men selv idisse tilfceldevii problemet forekom–
me med jcevne mellernrum. Det mest virksomme
rniddel er formentJig at sikreden nl')dvendige brug
af negative kontroller og vedvarende at diskutere
kvalitetssikringen.
Srerlige PCR applikationer
Reverse-transcriptionPCR
(RT-PCR) -kan i kom–
bination med en cDNA syntese benyttes til at de–
tektereog amplificeremRNA (Fig.
l).
mRNA iso–
leret fra vcev eller blod overscettes til "copy"DNA
(cDNA) med reverse-transkriptase, der syntetise–
rerenkomplement<erDNA streng fra enRNA ska–
belon. Proceduren er identiskmedkonstruktionen
afet normalt cDNAbibliotek. cDNA syntesenkan
initieres fra en specifik primer, med en oligo-dT
primer, eller med tilfceldige hexa- eller nonanu–
kleotider afhcengigt af omman 0nsker transkrip–
tion afet enkeltmRNAellerden komplettemRNA
population. cDNAet kan herefter amplificeres i en
normal PCR reaktion som beskrevet ovenfor. RT–
PCR er 10-100 gange mere fl')lsom end Northem
Blot og RNase protektion analyser, men selvom
cDNA syntesen er proportional med mRNA kon–
centrationen, vil den efterf0lgende eksponentielle
PCR amplifkation vanskeliggl')re en prcecis kvan–
titering af et givent mRNA
(6).
Man bl')r i l')vrigt
vcere opmcerksom på, at resultatet af analysen
fortrinsvis beror på kvaliteten af cDNA syntesen,
og at de velkendte probierner ved "primer-exten–
sion" er nedarvet i RT-PCR
(7).
Long-PCR
-
Ved en ordincer
Taq
PCR er det
normalt kun muligt at amplificere fragmenter op
til 2000 bp
(9).
Foretages amplifikationen istedet
med en blancting af
Tth
og
Vent
eller
Taq
og
Pwo
kanman imidlertid amplificere fragmenter på20-
30 kb. Dette er en stor fordel ved kortlcegning af
genstrukturer, hvor man ikke kender st0rrelsen af
introns, eller ved amplifikation af seedig store ex–
ons.
Long-PCR
kan imange tilfcelde også vcere et
godt udgangspunkt for efterf0lgende
nestede
PCR
i forbindelse med mutationsdiagnostik af store
komplekse gener.
Allel-specifik PCR
-
En effektiv initiering af
ekstensionen (polymeriseringen) ved PCR er kun
mulig, såfremt det sidste nukleotid i oligonukleo–
tidprimeren er komplementcert til "target" DNA.
Klinisk Kemi
i
Norden
2,
1997
Såfremt to alleler, enten på grund afen polymorfi
eller en mutation, varierer på en given position,
kanman selektivt amplificerehvert enkelt allel ved
at tilpasse primeren, sådenkunmatcher et afalle–
leme på den sidste base (10-13). Princippet har
stor vcerdi, såfremtman
f.
eks 0nsker at identifice–
remutanter i en baggrund afvild-type sekvenser -
enten fordi man har poolet en stor mcengde pa–
tienter, eller fordi man sl')ger at identificere enkel–
te mutanter blandt normale celler f.eks. i forbin–
delse med onkologisk diagnostik. Man b0r altid
benytte
Taq
polymeraser uden exonuclease/proo–
freading aktivitet, da enzymet ellers kan korrigere
den uparrede base. Desuden b0r man vcere op–
mcerksom på, at kun A-G, G-A og C-C mismat–
ches giver en effektiv inhibering af "primingen",
når man benytter
Taq
(5).
Sekventering afPCR produkter
-
Indtil slut–
ningen af firseme var det nl')dvendigt at klone ge–
nom eller cDNA fragmenterfor at sekventeredem.
Detteer radikalt cendret, idetman nu uden probie–
rner kan sekventere PCR fragmenter direkte, hvil–
ket har stor betydning ved detektion afmutationer
i sygdomsgener.
Stor set alle protokaller er baseret på Sangers
dideoxysekventering (14). I lighedmed sekvente–
ring af plasrnider kan man vcelge at endemcerke
sekventeringsprimeren eller inkorporere mcerke–
de dideoxynukleotider. Sidstncevnte har den for–
del, at kun dideoxynukleotid inducerede stop ses
pågelen. Omvendt vilman som regel opnåenmere
ensartet sekvensprofil ved brug af mcerkede pri–
mere, og dette kan vcere en fordel ved heterozygot
mutationsdetektion (Fig. 2). Den stigende brug af
sekventering til patientdiagnostikhar f0rt til mere
automatiserede protokoller. Benytter man en
Taq
polymerase uden exonuclease aktivitet, kan man
udnytte enzymets termostabilitet og foretage en
såkaldt "cycle-sequencing", hvor extensionen -
efter denaturering - kan gentages op til 25 gange.
Man har derfor kun behov for enminimal mceng–
de template (15). Til rutinebrug er det desuden en
fordel at indbyggeMl3-universalprimersekvenser
i sine PCR primere (Fig. 2)
(16).
Sekventering af
forskellige PCR fragmenter kan så foretages afen
robotmedbrug afde samme universalprimere. De
flesteDNA-sekvensmaskinerkanudenprobierner
sekventere 400 baser, og dette er tilstrcekkeligt til
sekventering afet gennemsnitsexonpå 250 til500
55
