Lighteyeler er velegnet til kvantilering af
speeifikke DNA og RNA molekyler.
Boe Sandahl
S~~Srensen
og Ebba Nex!IS
Klinisk Biokemisk afd. Århus Universitetshospital, KH, Danmark
Lighteyeler er en realtime PCR analysemaskine
der også kan analysere de dannede PCR produk–
ters smeltekurve. Udstyret er velegnet til kvanti–
tering af såvel DNA som RNA og til detektion af
polymorfier og mutationer. Vi har valgt at foku–
sere på anvendelsemuligheder for udstyret i for–
binde/se med kvantilering afDNA og RNA.
TEORETISK BAGGRUND FOR DNA OG
rnRNA KVANTITERING.
Det er muligt at kvantitere ned til omkring l O
molekyler af hhv. DNA eller mRNA, det vii sige
den mrengde af det specifikke mRNA/DNA der
typisk er tilstede i ganske få celler fra blod eller
vrev. Kvantiteringen består af:
l.
Omdannelse af
RNA
til
cDNA
ved hjrelp af
enzymet reverse transcriptase. Dette trin grel–
der kun for kvantitering af mRNA
2.
Omformering af det f/)nskede
DNA
ved
hjrelp af specifikke primere i en PCR reaktion.
Primeme er små DNA molekyler, der genken–
der og binder sig til det DNA man
~~Snsker
at
opformere. PCR (polymerase chain reaktionen)
består af gentagne opvarrnninger og
afk~~Slinger
af en reaktionsblancting med
pr~~Sve/standard
DNA, primere og DNA polymerase. For hver
opvarmings-afk~lingscyklus
vii mrengden af
DNA teoretisk set blive fordoblet og efter
typisk 20-30 cykler vii der vrere tilstrrekkeligt
DNA til at det kan kvantiteres. Der findes en
lang rrekke mindre udstyr, der automatisk sik–
rer den cykliske opvarrnning og
afk~~Sling
af
pr~~Sveme,
såkaldte PCR maskiner.
3.
Kvantilering af
DNA
dannet ved PCR reakti–
onen. Dette kan
g~~Sres
på flere forskellige
måder. Nedenfor er beskrevet kvantitering som
den sker ved brug af Lightcycler.
22
BESKRIVELSE AF LIGHTCYCLER
Apparat
Udstyret består af:
• en
thermocycler
hvor de hurtige rendringer i
temperaturen sker ved kliSling og opvarmning af
luft.
• en
pr(jvekarrusel
som indeholder glaskapillarer
hvori PCR reaktionen
forl~~Sber.
• en
detektionsenhed
som mäler den fluorescens
pr~~Sveme
udsender. Der mäles i tre forskellige
kanaler med hver sin
b~~Slgelrengde .
• en
PC
med software udviklet til udstyret.
Analyseprincip
Lighteyeler er en real-time PCR analysator, som
l~~Sbende
mäler den mrengde produkt der dannes
under PCR reaktionen. Når PCR reaktionen er
k~~Srt
til ende konstrueres en «smeltekurve».
PCR reaktionen: På Lightcycleren kan PCR
reaktionens
forl~~Sb
programmeres efter brugerens
~~Snske
som på en traditionel PCR maskine. En
vresentlig forskel er dog at temperatur styres ved
opvarmning og nedkliSling af luft. lEndringeme i
temperatur kan derfor foregå betydeligt hurtigere
end i normale PCR udstyr. Det betyder at analyse–
tiden kan reduceres fra de normale 2-3 timer ned
til omkring 20-30 minutter.
Real time PCR: Real time PCR er karakterise–
ret ved at dannelsen af PCR produkter
l~~Sbende
mäles gennem PCR opformeringen.. Det vil såle–
des vrere muligt at
f~~Slge forl~~Sbet
som vist i figur
lA. Figuren reprresenterer et typisk resultat for en
enkelt
pr~~Sve
opnået ved real time PCR.
Smeltekurve af PCR produktet: Smeltekur–
ven viser hvordan dobbeltstrenget DNA omdan–
nes til enkeltstrenget DNA som funktion af tem–
peraturen. Når PCR reaktionen er
l~~Sbet
til ende
hreves temperaturen gradvist til 94°C, og under
denne opvarmning mäles mrengden af dobbelt-
Klinisk Kjemi
i
Norden 3, 2001
