strenget DNA. Ved en temperatur der er karakte–
ristisk for hvert enkelt DNA molekyle vii moleky–
let smelte (gå fra dobbeltstrenget til enkelt–
strenget struktur). Smeltekurven kan anvendes til
at
afg~re
om der er flere typer af DNA i blan–
dingen, sådan som det typisk vil vcere tilfceldet
når man
unders~ger
for polymorfier eller mutatio–
ner. I forbindelse med kvantitering kan
unders~gelse af smeltekurveme bruges til at fastslå at der
kun er dannet et PCR produkt i reaktionen, og at
det er det korrekte.
Detektionssystemer: Sybr-green kan anven–
des i de fleste situationer. Stoffet udsender fluo–
rescens når det er bundet til DNA, men ikke når
det er frit i
opl~sningen.
Sybr-green kan derfor
scettes til
pr~ven
fra starten, og man kan herefter
f~lge
den mcengde DNA der dannes i
l~bet
af
PCR reaktionen ved at måle den fluorescens pro–
ven udsender.
Hybridiserende prober reprcesenterer et blandt
flere andre detektionssysterner (l) Ved denne
metode kan man benyttes to prober som har den
egenskab at de binder sig i umiddelbar forlceng–
else af hinanden på target DNA sekvensen. Der
udsendes kun fluorescens (FRET, fluorescens
resonance energy transfer) når de to prober sidder
på DNA, og ikke når de forekommer frit i
opl~s
ningen. Mcengden af DNA dannet i PCR reaktio–
nen vii derfor korrelere til mcengden af udsendt
fluorescens. For hver PCR cycle vii mcengden af
dannet DNA og dermed antailet af bunde prober
stige og dermed vil også fluorescensen stige.
Analysegang:
F~rst
oprenses DNA eller RNA
fra
pr~vematerialet.
Den optimale mcengde DNA
og RNA er henholdsvis ca. 0.01 og ca. 0.1 mg.
F~r
PCR
k~rslen
på Lightcycleren skal der tilscet–
tes specifikke primere for det target molekyle der
~nskes
opformeret. De
~vrige
komponenter i
PCR reaktionen kan
k~bes
som et kit der indehol–
der DNA polymerase, reaktionsbuffer, Sybr-green
og nukleotider. Et alternativt kit kan
k~bes
hvis
man
~nsker
at anvende hybridiserende prober.
Man kan anvende serielle fortyndinger af DNA
eller RNA indeholdende target sekvensen som
kalibratorer.
Pr~ver
med DNA eller cDNA anbringes i
pr~vekarusellen og herefter mäles mcengden af pro–
dukt som funktion af det antal PCR eyeler der
Klinisk Kjemi
i
Norden 3, 2001
kpres (figure lB). Det betyder at der for hver
prpve (kalibrator eller patientprove) optegnes en
kurve som tillader at man kan aflcese hvor mange
eyeler der skal til for at PCR amplifikationen
bevceger sig ind på et bestemt punkt i det ekspo–
nentielle område. Udfra de vcerdier der findes for
kalibratoreme optegnes en kalibreringskurve
(figure l
C)
og de ukendte prover aflceses.
A.
...
••-~.
====;:=;:-_,_-:c-:c-·
-,.--o:-·
--c·c-:o·----,:--. -:;.,....-,:-.-:c·-:o·---:c·-:·C'"'"O·
.
'
..
'""""""" """""""""
Cycle Number
B.
.,.
..
.
...
...
...
..
.
...
~
... ...
B
...
~
,._
...
g
,..
"'
... ...
00·
...
··-
cyele Numbar
c.
~
~
~
··-
z
~ ·~
.
~
Log Coneentratlon
Figure
J.
A. PCR kw·ve genem·et på Lightcycler. I den
fprste fase er den dam1ede mamgde PCR produkt under
detektionsniveau. Herefter sker der en eksponentiel
vrekst
i
danne/sen af PCR produkt og til slut nrermer
reaktionen sig en plateaufase. I real-time PCR anven–
des den eksponentiel/e del af kurven til kvantilering af
prpvens RNA eller DNA . B. Syv kalibralarer og en
negativ kontrot (den flade kw-ve uden amplifikation)
kprt med real time PCR.
C.
Kalibreringskurvefremstil–
let ved real time PCR (sample
1-7
i
Fig.lB).
EKSEMPLER P
Å
ANVENDELSE
Amplifikation af HER2 ved brystcancer:
Patienter der i deres turnor har for mange kopier
(amplifikation)
af
HER2 (Human Epidermal
growth factor Receptor 2) kan have glcede af en ny
23
