Lanthanider som fluorescensmark0rer:
Fysikken bak indirekte «delayed fluorescence»
HANS CHRISTOFERB0RRESEN
Klinisk-kjemisk avdeling, Rikshospitalet, 0027 Oslo (
)
Det er lett å merke aminagrupper i antistoffer og
antigener med Eu
3
+eller andre lanthanider (Figur
1). For å få frem fluorescensegenskapene, må
imidlertid lanthanidionet overf!i}res til et nytt
kompleks hvor man kan utnytte fenomenet «indi–
rekte eksitasjon». Dette innebrerer overf!i}ring av
eksitasjonsenergi fra ligand til lanthanidion.
Dessuten har fluorescensen fra lanthailider uvan–
lig lang levetid. Det er naturlig å sp!i}rre hva det
kan komme av, skj!i}nt det godt kan utnyttes måle–
teknisk uten at man beh!i}ver forstågrunnen (1,2).
Fluorescensforsterkning
(«Dissosiation-enhancement»)
I fri tilstand og i det chelatet som brukes til merk–
ingen (Figur 1), er Eu
3
+bare svakt fluorescerende.
Fluorescensen kan irnidlertid forsterkes betydelig
ved bruk av «dissociation-enhancement» prinsip–
pet (1,2). «Enhancement»-l!i}sningen inneholder
tre virkestoffer oppl0st i en acetat-ftalat buffer
(0.1 mol/L) med pH
=
3.2. Ved tilsetning av
«enhancement»-blandingen l0ses f0rst Eu
3
+ut av
bindingen til karboksylgruppene ved å senke pH.
Deretter danner hvert europiumion et chelat med
tre molekyler av en annen ligand (Figur 2), nem–
lig B-naftoyltrifluorodiaceton (15 pmol/L). De to
oksygenatomer i hver ligand inngår i keto-enol
tautomeri, og det dannes et planart system med
konjugerte dobbeltbindinger (Figur 2) med delo–
kaliserte elektroner. Disse inngår så i seks bin–
dende feBesorbitaler med Eu
3
+. Eu
3
+har imidler–
tid plass til elektronpar i ni bindende orbitaler. De
tre ledige orbitalene danner i utgangspunktet bin–
dinger til vann. Fluorescensen blir imidlertid ster–
kere hvis vannet helt eller delvis fortrenges og
erstaltes av virkestoff m. 2 i enhancementl0s–
ningen (3), nemlig tri-n-oktylfosfm-oksid
(TOPO, 50 pmol/L). Det tredje virkestoffet er det
uladede detergens Triton X-100. Dette danner
KliniskKjemi
i
Norden 4,2000
miceller som tar opp i seg europiurnkomplekset
(Figur 2). På denne måten blir europiumfluores–
censen forsterkel nrer en million ganger
i
forhold
til det europium-merkede antistoffets egenfluo–
rescens. Dette gir en deteksjonsgrense for euro–
pium på Sxi0-
14
mol/Lmed «time-resolved» fluo–
rornetri (1,2).
Indirekte eksitasjon
Eu
3
+ har lav molar absorbans og kan derfor
vanskelig exciteres ved selv å absorbere lys. I
komplekset med B-naftoyltrifluorodiaceton kan
imidlertid Eu3+ exciteres indirekte.Weissman (4)
oppdaget i 1941 at europium og enkelte andre
lanthanider som samarium og terbium kan eksile–
res i visse chelater ved at fotonene f0rst absor–
beres av liganden, hvoretter eksitasjonsenergien
overf!i}res til f. eks. Eu
3
+som så emitterer fluore–
scenslys i sin karakteristiske skarpe spektrallinje
ved 613 nm. Eksitasjonsspekteret svarer derfor til
absorbsjonsspektret for liganden, mens fluores–
censen svarer nfijye til kvantesprang i selve euro–
piumionet. Det er bare spesielt velegnede ligander
som kan forsterke fluorescensen fra Eu
3
+ på
denne måten: For det f0rste må liganden hameget
h!i}yere molar absorbans enn ionet selv har. For
det annet må ligandens energinivåer passe. For
det tredjemå overf!i}ringen av eksitasjonsenergien
fra liganden til ionet skje så hurtig at den kan kon–
kurrere med annet strålingsl0st energitap fra
liganden (quenching). Det oppnårman bl.a. ved å
erstalte hydrogenatomer i diacetongruppen med
fluor (Figur 2). Både i l!i}sningsmidlet (vann) og i
de eksiterte molekyler selv synes hydrogenato–
menes vibrasjoner å fasilitere stålingsl0st energi–
tap (3). Således 0ker fluorescensen hvis hydrogen
byttes ut med deuterium eller fluor.
15
