43
| 1 | 2012
Klinisk Biokemi i Norden
(
Fortsat fra side 40)
(
Fortsætter side 45)
MS) etablerat sig som ett bra alternativ (10). En liten
underavdelning på Mayo Medical Laboratories heter
Department of Laboratory Medicine and Pathology,
och har hand om CDG-analysen. De har sexton LCMS
instrument för rutinanalyser och två för metodutveck-
ling. Två av LCMS-instrumenten för rutinprover är
kopplade till varsitt Cohesive HPLC-system (11), vilket
fungerar som 4-8 parallella HPLC-system kopplade till
en MS. Varje sådant instrument kan köra ca 300 000
prover/år. Tekniken för CDG-analys som jag fick ta del
av är ny för oss på klinisk kemi i Lund, men har fun-
nits i drift på Mayokliniken sedan början av 2000-talet.
Mayokliniken använder sig av affinitetskromatografi
före LCMS (12). Allt är kopplat i samma system och
sker ”on-line”, med minimal provupparbetning och
korta analystider.
Systemet används för att semikvantitativt mäta
isoformerna av transferrin. Spätt serum appliceras
på affinitetskolonnen och kolonnen tvättas. Därefter
elueras transferrinet från antikropparna i affinitetsko-
lonnen med en sur buffert och koncentreras på en kort
analyskolonn. Sedan följer ett tvättsteg för att avlägsna
bland annat fosfater som dämpar och stör signalerna
i masspektrometern. Transferrinet elueras senare ut
från analyskolonnen in till masspektrometern med en
enkel gradient. Metoden ger en analystid på 6,5 min
från injektion av spätt serum till svar.
Hela molekylen analyseras i masspektrometern
d.v.s. introducerade molekyler fragmenteras inte. Frag-
mentering är mycket användbart när två molekyler
med snarlik molekylvikt ska skiljas åt. Vid fragmen-
tering fragmenteras molekyler från olika substanser
oftast olika och kan på så sätt separeras. När det
gäller transferrin är skillnaden mellan isoformerna
i storleksordningen kDa. Dessutom är provet p.g.a.
affinitetsuppreningen mycket rent. Fragmentering är
således onödig.
Masspektrometern justeras att skanna lämpligt
massområde, i vårt fall 2000-3000 Da. Hur går 2000-
3000
ihop med transferrins massa på ca 79600 Da?
Masspektrometrar fungerar enkelt beskrivet som ett
eller flera massfilter framför en känslig men promis-
kuös detektor. Dessa massfilter baseras på både massa
och laddning. Två partiklar i vakuum med samma
”
massa-till-laddnings”-förhållande rör sig i samma
bana när de utsätts för samma elektromagnetiska fält.
Masspektrometerns utsignal ges alltså sommassa över
laddning, m/z. Oftast beror antalet laddningar i en
molekyl på antalet protonerings- och deprotonerings-
ställen. Exempelvis ger en molekyl med laddningen
plus ett, ett resultat med sin faktiska massa plus ett
(
protonvikten adderas). Transferrin har många fler
laddningar per molekyl och dess m/z ratio blir såle-
des lägre än molekylvikten. Dessutom protoneras ett
protein inte homogent, olika molekyler av samma
protein protoneras olika mycket i det ordnade kaos
Figur 3.
Exempel på N-glykaner från trans-
ferrin funna i CDG typ II patienter.
