![]()
23
enkelte pasient kan genotyping av legemiddelmetabo-
liserende enzymer være et nyttig hjelpemiddel til å
velge medikament og dose med høy forventet tera-
peutisk effekt kombinert med lav bivirkningsrisiko.
Tatt i betraktning den stadig mer heterogene popula-
sjonen i de nordiske land vil farmakogenetiske analy-
ser kunne bidra til en mer sikker og differensiert
behandling av ulike etniske grupper.
Medikamentell terapistyring nå og i fremtiden
Frem til nå har styring av medikamentell behandling
blant annet basert seg på konsentrasjonsmålinger av
medikamenter i biologiske væsker og fortolkning av
disse resultatene. Dette forutsetter både kunnskap om
forholdet mellom konsentrasjon og respons, at pasien-
ten etterlever behandlingsregimet og at prøvene tas til
korrekt tidspunkt. I fremtiden vil medikamentell tera-
pistyring også inkludere farmakogenetiske analyser
slik at valg av legemiddel og dosering kan gjøres før
behandlingsstart eller under pågående terapi, basert på
kunnskap om forventet legemiddelrespons (4). CYP-
genotyping kan videre gi prediktiv informasjon for
mange legemidler på én gang siden ett CYP-enzym
kan omsette flere legemidler. Resultatet er konstant og
gyldig gjennom livet og selve genotypingen influeres
ikke av endring i hormonnivåer, interkurrente
sykdomstilstander, annen samtidig legemiddeladmini-
strering, pasientcompliance, korrekt prøvetakingstids-
punkt eller om steady-state forhold er oppnådd.
Det vil i fremtiden være et klart behov for både de
tradisjonelle og nye analysemetodene i medikamen-
tell terapistyring da de representerer komplementære
tilnærminger.
Lightcycler – velegnet analyseprinsipp
ved mutasjonsanalyser
Rutinemessig genotyping på klinisk kjemiske labora-
torier gjøres i økende grad ved sanntids kvantitativ
PCR (polymerase kjedereaksjon) som fortløpende må-
ler den mengde produkt som dannes under PCR
reaksjonen, kombinert med mutasjonspåvisning ved
hjelp av en eller annen form for probe-hybridise-
ringsteknikk. Lightcycler (Roche Diagnostics) er vel-
egnet til kvantitering av DNA og RNA (9), samt til
detektering av polymorfismer og mutasjoner. Tem-
peraturen i PCR-kapillæret styres ved oppvarming og
nedkjøling av luft. Temperaturendringene kan derved
foregå mye hurtigere enn ved bruk av tradisjonelt
PCR utstyr. Dette reduserer analysetiden fra 2-3 timer
| 2 | 2003
Klinisk Biokemi i Norden
til omkring 30 minutter. Mutasjonsanalysene er basert
på analyse av smeltekurver for allel-spesifikke fluore-
scens-resonans-energioverføringsprober (FRET; fluo-
rescense resonance energy transfer) hybridisert til
PCR-amplifisert DNA. Prinsippet er basert på to
hybridiserende prober hvis sekvens er valgt slik at de
kan bindes til ”target-sekvensene” på det amplifiserte
DNA-fragmentet umiddelbart i forlengelsen av hver-
andre i et ”hode-til-hale”-arrangement. Dette bringer
de to probenes fargestoffer (fluoroforer) svært nær
hverandre. Dette gir opphav til FRET-fenomenet der
energien fra donorfluoroforen eksiterer akseptorfluor-
oforen. I praksis sendes det kun ut fluorescens fra
akseptorfluoroforen når de to probene sitter inntil
hverandre på DNA, og ikke når de forekommer fritt i
oppløsningen. Mengden av utsendt fluorescens fra
akseptorfluoroforen vil derfor korrelere til mengden
DNA dannet i PCR-reaksjonen. Én mismatch mellom
probe og amplifisert DNA gjør at proben fester seg
dårligere til templatet. Dette senker smeltepunktet
(den temperaturen der 50% av proben er hybridisert
til templatet og 50% er fritt i løsningen) med 5-10°C i
gjennomsnitt. En mismatch detekteres således ved at
probens smeltepunkt reduseres i forhold til hybridise-
ring til fullstendig komplementært DNA (figur 1).
PCR-primerne og deteksjonsprobene som blir brukt i
våre rutineanalyser er spesifikke for det aktuelle CYP-
genet, slik at verken beslektede CYP-gener eller pseu-
dogener medbestemmes.
Lightcycler gir minimal risiko for ”carry-over”-
kontaminering fra tidligere PCR prøver til nye pasi-
entprøver ved at prøverørene analyseres i sanntid
med interne prober uten at korken må tas av med risi-
ko for å spre PCR-produkter. I tillegg brukes reagen-
ser (deoksyuridintrifosfat) i PCR-syntesen som gjør at
PCR-produktene kan brytes ned enzymatisk (uracil-
N-glycosylase) slik at de ikke kan fungere som tem-
plat for neste PCR-reaksjon. I hvert oppsett er det
inkorporert positive og negative kontrollreaksjoner. I
tillegg gjøres DNA-ekstraksjon samt pipettering av
reagenser og prøvemateriale ved hjelp av robot med
elektronisk logg som sørger for minimal risiko for
prøveforbytning. Slik prøveforbytning er hyppigste
årsak til feilrapportering av manuelle, genetiske ruti-
neanalyser.
Farmakogenetisk diagnostikk
Målet med farmakogenetiske analyser er å identifise-
re risikopasienter hvor man kan forvente abnormal
