36 |
Klinisk Biokemi i Norden · 2 2015
kalcium (8-10). Orsaken var förstås att den binder
kalcium. Det var första gången det visades att en
EGF-lik domän kan binda en kalciumjon. Nu vet vi
att det finns massor av extracellulära proteiner och
membranproteiner som har Hya och/eller
erytro
-
b
-
hydroxyasparagin (Hyn) och binder kalcium. Upp-
skattningsvis en tredjedel av alla EGF lika domäner
har en Hya eller en Hyn och binder en kalciumjon.
Membranproteinet NOTCH, som är en regulator av
celldifferentiering, är ett bra exempel. Det har 36
EGF-lika domäner och finns såväl hos människa
som hos Drosophila. Av de 36 domänerna tycks
21 ha en Hya/Hyn och binda kalcium. Fibrillin, ett
viktigt protein i det extracellulära matrix, har 43
Hya- innehållande och kalciumbindande EGF-lika
domäner. Mutationer i de EGF domänerna i fibrillin
kan leda till olika bindvävssjukdomar, t.ex. Marfans
syndrom (11).
Var i domänen det kalciumbindande sitet finns vis-
ste vi inte då dess tredimensionella struktur ännu var
okänd. Men genom att göra en jämförelse av EGF-lika
domäner, som innehöll Hya med sådana som saknade
Hya, med avseende på kalciumbindande förmåga,
kunde vi ta några steg i rätt riktning. Det visade sig
att det är de Hya/Hyn innehållande domänerna som
binder kalcium medan de andra inte gör det.
Det var också klara strukturrestriktioner på de
Hya-innehållande, kalciumbindande domänerna
(Fig. 2). För att den aktuella Asp ska hydroxyleras
till Hya måste det vara åtta aminosyror mellan Cys
tre och fyra och dessutom måste den Asp (D) eller
Asn (N) som hydroxyleras till Hya eller Hyn finnas
två steg C-terminalt om Cys tre medan det ytterligare
fem steg mot C-terminalen alltid finns en hydrofob
aminosyra, Tyr (Y), Phe (F), Ile (I), Leu (L) (12-14).
Längre än så kom vi inte.
Man hade länge, men utan framgång, försökt att
kristallisera EGF för att bestämma dess tredimen-
sionella strukturen med röntgenkristallografi. Det
fick Ian Campbell och medarbetare vid universite-
tet i Oxford att försöka bestämma strukturen med
kärnresonansspektrometri (NMR). Det var en i sam-
manhanget ny metod och den var bara användbar på
små proteiner eller proteindomäner. Campbell och
medarbetar var bland pionjärerna. De kunde 1987
publicera strukturen hos EGF (15). Baserat på struk-
turen och med hänvisning till att vi visat att vissa
EGF-lika domänerna binder kalcium, kunde de visa
var i domänen det kalciumbindande sitet är beläget.
Det blev då uppenbart hur Hya/Hyn (
b
i Fig. 3) är
involverade i kalciumbindningen. För oss var det ett
viktigt arbete som rätade ut flera frågetecken.
NMR studierna visade också att Hya och en av
de hydrofoba aminosyror, som våra sekvensjäm-
förelser visat vara konserverad (Tyr, Phe, Ile, Leu),
alltid finns intill varandra i en
b
-pleated sheet (Fig.
3). NMR strukturen gav oss en viktig pusselbit till.
Den visade att i de EGF-lika domäner som har Hya
så finns det alltid två negativt laddade aminosyror
(Asp och/eller Glu, D och G i Fig. 3) N-terminalt om
den första Cys resten (C i Fig. 3). Karboxylgrupperna
i de N-terminala Asp/Gu är dessutom ligander till
kalciumjonen, liksom
b
-karboxylen i Hya. Slutligen
bör det framhållas att det inte finns någon Hya i pro-
trombin, som saknar EGF-lika domäner.
Den EGF-lika domänens affinitet för kalciumjoner
är tillräckligt hög (K
d
≈ 100
m
M) för att sitet skall vara
mättat vid den fysiologiska koncentrationen av fria
kalciumjoner. Genom att vi funnit ett sätt att kontrol-
lerat degradera FX med trypsin kunde vi rena stora
mängder av ett proteolytiskt fragment, som innehöll
Gla domänen och den N-terminala, Hya-innehål-
lande, EGF lika domänen (16). Det skulle hjälpa oss
Fig. 3. Figuren visar en schematisk struktur av EGF1 i faktor
IX. Alla Cys
©
är gula medan de aminosyror som är ligander
till kalciumjonen är blå. Som framgår av bilden är det åtta
aminosyror mellan Cys 3 och Cys 4, som bildar en så kallad
b
-pleated sheet. Hya (
b
i figuren) och den efterföljande Asp
(D) är båda ligander till kalciumjonen. Övriga ligander är
D, G och Q, N-terminalt om den första C. Intill Hya, fem
steg mot C-terminalen, ligger den konserverade Tyr (Y).
Motsvarande domäner i faktorerna VII, X och Protein C
har en påfallande sekvenslikhet.
