Klinisk Biokemi i Norden · 2 2015
| 35
nering. Den behövdes t.ex. för att fastlägga var Gla
fanns i sekvensen, var kolhydratsidokedjorna fanns,
liksom för att ta reda på hur disufidbryggorna var
arrangerade. Dessutom var det nödvändigt för att få
veta om det, förutom Gla, fanns andra posttransla-
toriskt modiferade aminosyror i Protein C, vilket det
skulle visa sig göra.
När jag lyckades intressera min kollega Per Fern-
lund att vara med såg det bra ut. Att ha någon att
utbyta synpunkter med var ovärderligt. Dessutom
hade vi två mycket skickliga biomedicinska analyti-
ker till vår hjälp.
Protein C består av två peptidkedjor som binds
samman av en disulfidbrygga. Genom att reducera
disulfidbryggorna kunde vi separera de två kedjorna
från varandra. I den något kortare, så kallade lätta
kedjan, fann vi nio Gla medan den längre kedjan
innehöll serinproteasdelen. Vi digererade den lätta
kedjan med trypsin och isolerade de peptider som
bildats. Vid sekvensningen av en peptid som visade
sig innehålla aminosyrorna från position 69 till 75
fick vi problem. Aminosyran i position 71 kunde
vi inte identifiera. Det var
absolut
ingen av de tjugo
vanliga. Än en gång fick vi vända oss till experter på
NMR och masspektrometri för att få hjälp.
Det visade sig att aminosyran i position 71 var en
aminosyra som aldrig tidigare hade hittats i ett pro-
tein, nämligen
erytro
-
b
-hydroxyasparaginsyra, som
vi förkortade till Hya (Fig. 2; 5,6). Till
b
-kolet var fyra
olika grupper bundna, en –OH, en –COO
–
en H och
en –CH, vilket innebar att kolet var assymetriskt.
Vid bestämning av Hya efter sur hydrolys av Protein
C kunde vi också notera att hydrolysen ledde till att
en del av
erytro
formen omvandlades till
treo
, vilket
var lätt att visa då de två formerna separerade från
varandra vid kromatografi på en anjonbytare.
Snart fann vi Hya också i den lätta kedjan från FIX
och FX (2). Men vad har Hya och de C-terminala två
tredjedelarna av kedjan för funktion? Vi visste att där
finns tolv cysteinrester, som med stor sannolikhet
var förenade genom disulfidbryggor. Vad var det för
typ av proteindomäner? För att sätta vårt problem i
perspektiv kan vi titta lite bakåt i tiden.
Hya finns i proteindomäner som liknar den epi-
dermala tillväxtfaktorn, EGF
I början av sextiotalet isolerade man en intressant
peptid från den submaxillära körteln hos möss. Den
visade sig vara ett kraftigt mitogen, som stimulerar
tillväxt av olika epteliala och epidermala celler. Den
humana motsvarigheten, den epidermala tillväxtfak-
torn (EGF), har 53 aminosyror, varav sex är cystein
(Cys), som är förenade av disulfidbryggor.
Mindre än ett år efter att vi hittat Hya i Protein
C publicerade Ross Doolittle, och hans medarbetare
vid University of Southern California, ett arbete
som handlade om hur de hade klonat cDNA till
EGF prekursorn och visat att den är ett membran-
protein med nio EGF-lika domäner och drygt 1000
aminosyror (7). Den N-terminala domänen är den,
som efter proteolys av prekursorn, blir EGF. Flera av
de EGF-lika domänerna i prekursorn har en påtag-
lig sekvenslikhet med den lätta kedjan i faktorerna
VII, IX, X och Protein C (7). I var och en av de fyra
koagulationsfaktorerna visade det sig snart finnas
två EGF lika domäner, som är belägna C terminalt
om Gla domänen. Hya finns alltid i den N terminala
delen av dem (8).
När vi isolerat den aminoterminala, Hya-inne-
hållande, EGF-lika domänen såg vi snart att dess
anodala elektroforetiska mobilitet var lägre i en buf-
fert som innehöll kalciumjoner än i en som saknade
Fig. 2. Erytro-
b
-hydroxyasparaginsyra (Hya)
och erytro-b-hydroxxyasparagin (Hyn).
