38 |
Klinisk Biokemi i Norden · 2 2015
Kanske är askorbat kofaktor också vid hydroxy-
leringen av asparaginsyra och asparagin? Vid sidan
av människan är marsvinet den enda vertebrat som
drabbas av skörbjugg/skorbut vid C-vitaminbrist.
Övriga vertebrater tillverkar C-vitamin själva. Vi
skaffade oss marsvin och satte dom på en diet som
relativt snabbt gjorde dem scorbutiska. Men icke –
trots att de fick skorbut så gick inte halten av Hya
ned i de K-vitaminberoende proteinerna (20). I själva
verket finns det rader av dioxygenaser, som hindrar
oxidering av Fe
2+
till Fe
3+
i enzymets aktiva site utan
att behöva askorbat som kofaktor.
Dioxygenaser är komplicerade enzymer. Jag
behövde hjälp. I Sverige fanns vid denna tid två
experter på dioxygenaser: Sven Lindstedt, professor
i klinisk kemi vid Sahlgrenska Sjukhuset i Göteborg
och hans medarbetare och kollega, Elisabeth Holme.
Jag frågade dem om de var intresserade av att sam-
arbeta för att ta reda på mer om Asp hydroxylaset.
Och visst var de det. Första frågan var förstås vad vi
skulle försöka med som substrat till enzymet. Våra
studier hade ju redan visat att Hya satt två aminsyror
från Cys tre och att det var en isoleucin/valin intill
den i en
b
-pleated sheet (Fig. 3). Det sannolika var
att en intakt EGF-lik domän behövdes som substrat
för hydroxylaset. Fast, kanske fungerade vilken liten
Asp innehållande peptid som helst. Vi prövade och
det fungerade förstås inte (20).
Allt talade alltså för att substratet måste bestå av
en intakt EGF-lik domän med tre disulfidbryggor
och med de strukturkrav som jag redan beskrivit. Så
stora peptider hade vi inte syntetiserat och än mindre
hade vi någon erfarenhet av peptider med Cys rester
som skulle bilda disulfidbryggor.
Ett par år tidigare hade den moderna peptidsyn-
tesens fader, professor Bruce Merrifield, vid Rocke-
felleruniversitetet i New York syntetiserat EGF och
fått den rätt veckad med sina tre disulfidbryggor
(21,22). Det var ett stort genombrott i peptidsynte-
sen. Merrifield hade modifierat de gängse metoderna
för peptidsyntes på ett genialt sätt. Han fäste den
första, N-terminala, aminosyran på små kulor, och
byggde sedan på aminosyrorna en och en. Genom
att ha peptiden fäst på kulorna var det lätt att efter
varje steg tvätta bort alla reagens och börja om
från början med nästa aminosyra. Det underlättade
syntesen enormt. Merrifields banbrytande utveckling
av peptidsyntesen gjorde att han belönades med
Nobelpriset i kemi 1984.
Jag tänkte att det kunde väl aldrig vara fel att skriva
och fråga omMerrifield kunde tänka sig att hjälp oss
med syntesen av en EGF-lik domän, som borde fung-
era som substrat till hydroxylaset. Jag fick ett positivt
respons och reste genast till New York för att besöka
honom på Rockefelleruniversitetet. Där fanns också
en annan av mina idoler, professor Stanford More,
som med rätta betraktas som aminosyraanlysatorns
fader. Honom fick jag också besöka och kunde bese
hans första hemgjorda aminosyraanalysator.
Vi ville ha den N-terminala EGF-lika domänen i
faktor IX som substrat för hydroylaset, fast med Asp
i position 64 i stället för Hya. Det dröjde inte länge
förrän en av Merrifields många medarbetare hade
syntetiserad domänen och skickat den till oss. Vi
testade genast om den skulle fungera som substrat
och – det gjorde den (23). Det här Asp
b
-hydroxylaset
är således ett enzym med mycket höga krav på sub-
stratet; endast Asp i rätt position i en EGF-lik domän
hydroxyleras. För vår del var det över här. Vi visste
att hydroxylaset är ett dioxygenas, men ett som inte
behöver askorbat, och att endast Asp i rätt position i
en EGF-lik domän hydroxyleras. Det var nog för oss.
Fig. 5. Figuren visar en schematisk bild av Protein C mole-
kylen. Längst ner är Gla domänen (grön) med sex bundna
kalciumjoer (vita klot) Övanför är de två EGF-lika domä-
nerna (gula). Mellan Gla och den aminoterminala EGF-lika
domänen syns ännu en kalciumon, den som fixerar Gla
domänen och den aminoterminala EGF-lika domänen i
förhållande till varandra (jämför med Fig. 5). Överst, till
vänster, syns serinproteasdomänen (blå). Även den har en
bunden kalciumjon.
