![]()
17
| 2 | 2009
Klinisk Biokemi i Norden
vi klara av att rena i den mängd som behövdes för
NMR. Det var arbetsamt men inte ogörligt; vi fick ju
blod från slakteriet. Däremot var det otänkbart att
få fram de mängder av den omodifierade peptiden
som krävdes för NMR. Det hade krävt att vi köpt ett
flertal kor och behandlat dem med dikumarol. Det
logiska var förstås att syntetisera peptiden, d.v.s.: Ile-
Glu-Glu-Val. Problemet var att jag saknade erfaren-
het av peptidsyntes.
Ungefär ett år tidigare hade Per Fernlund flyttat
från institutionen för medicinsk kemi i Lund till
kliniskt kemiska laboratoriet vid MAS. Hans forsk-
ning vid institutionen för medicinsk kemi hade givit
honom stor erfarenhet av peptidsyntes. Jag lyckades
intressera honom för projektet och han började
genast syntetisera den tetrapeptid, som behövdes
som kontroll vid NMR studierna.
Med peptiderna i fickan åkte Per och jag till Lund
och fick Willam Egan att titta på dem med proton
NMR. Nu kom nästa överraskning (Fig. 5). Pepti-
den från normalt protrombin hade färre protoner än
motsvarande syntetiska peptid – varje glutmainsy-
rarest hade två protoner färre på
-karboxylen. Hur
kunde det vara förenligt med att den hade samma
aminosyrasammansättning efter sur hydrolys som
peptiden från det abnorma proteinet och dessutom
en högre anodal mobilitet vid högspänningselek-
trofores, d.v.s. hade mer negativ laddning än den
syntetiska peptiden?
Jag kunde i stort sett ingenting om NMR spek-
trometri och var förbryllad. Även William Egan
kliade sig i huvudet. Men rätt som det var gick det
upp för Per. Plötsligt utbrast han: ”Det måste vara
-karboxyglutaminsyra”. Det innebar att båda Glu
resterna i peptiden från det normala protrombinet
hade en extra karboxylgrupp på
-kolet (Fig 6).
Glu har två protoner på
-kolet. Med ytterligare en
karboxylgrupp på
-kolet blir den modifierade Glu
resten ett malonsyraderivat, vilket innebär att den
enda kvarvarande protonen får ett lågt pK. Eftersom
proton NMR utförs i D
2
O kommer den att bytas ut
mot D och följaktligen kommer det inte att synas
någon proton på
-kolet i peptiden från normalt
protrombin.
Per och jag kontaktade Peter Roepstorff och
berättade för honom vad som hänt. Han kontrolle-
rade genast sina masspektra och fann att de var helt
förenliga med
-karboxyglutaminsyra. Vi tog genast
tåget till Odense för att stilla vår nyfikenhet.
En viktig egenskap hos malonsyra är att den
dekarboxyleras när den värms upp under sura
betingelser, något man ofta använder sig av vid
organisk syntes. Det förklarar varför upphettning
av peptiden från protrombin under sura betingelser
ledde till dekarboxylering av Gla resterna med Glu
som resultat. Om man däremot upphettar peptiden
under alkaliska betingelser sker inte detta (Fig. 7).
Dekarboxyleringen under sura betingelser förklarar
naturligtvis också varför vi, efter sur hydrolys, fick
en identisk aminosyrasammansättning på tetrapep-
tiden från normalt protrombin och peptiden från
det abnorma protrombinet.
Upptäckten av
-karboxyglutaminsyra, som kom
att kallas Gla, var ett viktig steg framåt. Dess före-
komst i normala K-vitaminberoende koaguations-
Fig 6.
Strukturen hos tetrapeptidens från protrombin: Leu-
Gla-Gla-Val. Den extra karboxylen hos Gla jämfört med Glu
gör att kvarvarande proton på gammakolet blir utbytbar mot
en proton från lösningen, D
2
O. Varje Glu rest har således för-
lorat två protoner som framgår av NMR spektra.
Fig 7.
Högspänningselektrofores vid pH 6,5 av syntetisk tetra-
peptid (Leu-Glu-Glu-Val, position sex till nio) och motsvaran-
de peptid från normalt protrombin. S är kontroller och avser
två obehandlade prov. A och B är den syntetiska tetrapeptiden
medan C och D är motsvarande peptid från protrombin.
Peptiderna (ca 20 nmol) löstes i 0,1 M HCl och evaporerades
sedan till torrhet i rumstemperatur. Därefter förseglades gla-
sampullerna under N2 och värmdes till 150° i 10 min varefter
de öppnades och peptiderna löstes upp och analyserades med
högspänningselektrofores vid pH 6,5. A och C är peptiderna
före uppvärmning medan B och D är de uppvärmda peptider.
Den värmda peptiden från protrombin har uppenbarligen för-
lorat negativ laddning och blivit identisk med den syntetiska
peptiden. Den hade dekarboxylerats.
(Fortsætter side 18)
