![]()
12
| 2 | 2009
Klinisk Biokemi i Norden
kare och dessutom omvittnat karismatiska personer.
Den hämning av blodkoagulationen som framkal-
las av warfarin testas nu med PK(INR) metoden. Ju
lägre aktivitet hos de K-vitaminberoende koagula-
tionsfaktorerna, desto längre koagulationstid. Orsa-
ken till den förlängda koagulationstiden ansågs vara
att de vitamin K beroende proteinernas koncentra-
tion sjönk under behandlingen med dikumarol. I
slutet av sextiotalet öppnade Per-Olof Ganrot och Jan
Niléhn, den senare verksam vid kogulationslaborato-
riet vid MAS, ett nytt kapitel i forskningen om anti-
koagulatia. Laurells nya immunokemiska metoder
(Faktaruta 2) gjorde det möjligt för dem att visa att
bilden var mer komplicerad än vad man haft anled-
ning att anta baserat på PK(INR) metoden (5).
Protrombin som inte binder kalcium – vad kan
det vara?
Plasma från patienter som behandlades med diku-
marol undersöktes med raketelektrofores och med
korsad immunelektrofores. När de använde rakete-
lektrofores i kombination med ett monovalent kani-
nantiserum mot protrombin såg Ganrot och Niléhn
att protrombinets koncentration inte sjönk i den
utsträckning man kunde förvänta sig av PK värdena
(5). Med hjälp av den korsade immunelektroforesen
kunde de göra två observationer. Det första steget
innebär elektrofores i en barbitalbuffert (pH 8,6), som
antingen innehåller 2 mM kalciumklorid eller 2 mM
EDTA. Den åtföljs av en elektrofores i 90° vinkel mot
den första, in i en antiseruminnehållande gel. De såg
då att protrombinets elektroforetiska mobilitet påver-
kades av kalciumjonerna i bufferten – protrombin
binder uppenbarligen kalcium (6).
När plasma från patienter, som behandlades med
dikumarol, undersöktes sjönk som väntat koncen-
trationen av det normala protrombinet när behand-
lingen inleddes. Men Ganrot och Niléhn gjorde ännu
en viktig observation. De noterade att dikumarol-
behandlingen ledde till bildandet av en annan, låt
oss kalla den abnorm, form av protrombin, som till
skillnad från den normala, inte binder kalciumjoner
(Fig 4A). När koncentrationen av det normala pro-
trombinet minskade så ökade koncentration av den
abnorma formen. Om plasman fick koagulera aktive-
rades det normala protrombinet medan inget hände
med den abnorma, icke kalciumbindande formen.
Några månader senare började jag på laboratoriet.
Det blev min uppgift att försöka ta reda på varför det
bildas en biologiskt inaktiv, icke kalciumbindande
form av protrombin när patienter behandlas med
dikumarol/warfarin. Ett första steg mot att besvara
frågan var förstås att ta reda på vad det är för skill-
nad i struktur mellan den biologiskt aktiva och den
inaktiva formen. Med dagens metoder för proteinre-
ning och masspektrometri av proteiner och peptider
hade problemet varit lätt att lösa. För 35 år sedan
var det annorlunda. Proteinkemi, och inte minst
sekvensbestämning av proteiner, krävde betydande
mängder protein. Dessutom saknade vi mycket av
den utrustning som behövdes.
Jag måste börja med att rena det abnorma pro-
trombinet. Fem minuters eftertanke visade att det
var omöjligt att arbeta med humant material. Det
skulle inte gå att få fram de mängder plasma från
dikumarol/warfarin behandlade patienter som kräv-
des för reningen. Vi bestämde oss därför att använda
bovin plasma och började med det som var lätt,
nämligen att rena det normala protrombinet. Blod,
med citrat som antikoagulans, fick vi från ett lokalt
slakteri. Protrombinets koncentration är cirka 100
mg per liter plasma och vi fick tiotals liter blod. Vi
avskiljde citratplasman från blodkropparna med en
separator. Sedan satte vi BaCl
2
till plasman, så att
olöslig bariumcitrat bildades. Protrombin, liksom de
andra K-vitaminberoende koagulationsfaktorerna,
bands till bariumcitraten som snabbt sedimente-
rade vid centrifugering. Efter tvättning av preci-
pitatet eluerade vi med EDTA och fortsatte sedan
med jonbyteskromatografi varefter protrombinet
var homogent.
Nu var det tid för det abnorma protrombinet. Vi
köpte två oxar och hyrde in dem på en gård utanför
Malmö. En veterinär injicerade dem med dikumarol
och tog blodprover efter några dagar. Test med den
korsade immunelektroforesen visade att dikumarol-
tillförsel, även hos nötkreatur, inducerar syntes av
en icke kalciumbindande form av protrombin (Fig.
4B). När koncentrationen av abnormt protrombin
var optimal, d.v.s. så hög som möjligt utan att det var
risk för blödning, tappades några liter blod.
Om reningen av normalt protrombin var lätt så
var reningen av det abnorma protrombinet lång-
dragen och arbetskrävande – det binder ju varken
kalcium eller barium och adsorberas således inte till
bariumcitrat. Jag måste utveckla en ny metod. För
(Fortsat fra side 11)
(Fortsætter side 14)
