![]()
16
| 2 | 2009
Klinisk Biokemi i Norden
Väl hemma satte jag igång med att jämföra Frag-
ment 1 från det normala och det abnorma protrom-
binet på egen hand. Vi började med en enzymatiskt
digestion, för det mesta med trypsin, och separerade
sedan peptiderna med hjälp av elektrofores på pap-
per under mycket hög spänning, vilken åtföljdes av
papperskromatografi. Elektroforesen utfördes i en
stor tank med buffert i botten och i ett kärl upptill.
För övrigt var tanken fylld med klorbensen och kyl-
des med vatten som pumpade genom ett par glasrör.
Efter elektrofores och färgning av en del av pappret
med ninhydrin klipptes den intressanta delen ut och
syddes fast vid ett annat papper för efterföljande
kromatografi. Åter färgning varefter de intressanta
peptiderna eluerades och utsattes för sur hydrolys,
aminosyraanalys och eventuellt sekvenering. Vi fick
två kromatogram, vilka som väntat till stora delar
var identiska (12).
Bland de negativt laddade peptiderna fanns det
emellertid klara skillnader i elektroforetisk mobili-
tet mellan peptiderna från de två formerna av pro-
trombin. Vi koncentrerade oss på två tetrapeptider
som visade sig svara mot positionerna sex till nio
i protrombin, en från det normala och en från det
abnorma protrombinet. Båda hade, efter sur hydro-
lys, sammansättningen: en valin (Val), en isoleucin
(Ile) och två glutaminsyra (Glu). Peptiden från det
abnorma protrombinet hade den elektroforetiska
mobilitet man kunde förvänta sig från aminosyra-
sammansättningen, medan den från det normala pro-
trombinet hade en påtagligt högre anodal mobilitet.
Vi upptäcker en ny aminosyra
När vi bestämde sekvensen på peptiden från det
abnorma protrombinet fann vi en aminoterminal
Ile och en karboxyterminal Val och däremellan de
två Glu. I peptiden från normalt protrombin såg vi
Ile och Val men ingen Glu. I stället för Glu fick vi en
topp i kromatogrammet (HPLC) som vi inte kunde
identifiera. Det var uppenbart att de två Glu var
modifierade på ett sätt som gav extra negativ ladd-
ning. Det krävdes masspektrometri för att få ett svar
på frågan. Här tog det stopp för mig. Jag saknade de
kunskaper som krävdes för att lösa problemet. Dess-
utom hade vi ingen masspektrometer.
Jag råddes att kontakta Peter Roepstorff, som
var professor vid Universitetet i Odense och unge-
fär jämnårig med mig. Han var redan då en av de
ledande experterna i Europa på masspektrometri.
Att bestämma strukturen med masspektrometri var
emellertid långt svårare på den tiden än det skulle
varit med dagens metoder. Tolkningen av våra
spektra var också svår. Ungefär samtidigt vände jag
mig till professor Sture Forsén vid Institutionen för
fysikalisk kemi vid Tekniska Högskolan i Lund. Han
var en ledande expert på NMR i Sverige. Efter en
stunds diskussion sammanförde han mig med en
post doc från NIH, William Egan. De ansåg att det
med hjälp av proton NMR borde gå att identifiera
vad det var som var kopplat till glutaminsyrarester-
nas gammakarboxyler.
För strukturstudier med NMR behövdes ungefär
ett milligram av peptiden. Dessutom var det för
tolkningen av spektra från peptiden från normalt
protrombin nödvändigt att jämföra dem med mot-
svarande spektra från peptiden med omodifierade
Glu rester, d.v.s. peptiden från det abnorma pro-
trombinet. Peptiden från normalt protrombin kunde
Fig 5.
1H NMR spektra (100 MHz) av den syntetiska tetra-
peptiden (nederst) och motsvarande peptid från protrombin
(ovanför). Skalan på X-axeln är i ppm. Peptiderna var lösta i
D2O. Om man ser på region A så är den närmast identisk i de
båda peptiderna medan en jämförelse av regionerna B och C
tyder på att peptiden från protrombin har fyra protoner färre.
(Fortsat fra side 14)
