Klinisk Biokemi i Norden · 3 2013
| 29
ytterligare ett steg. Både APC och PCI har affinitet
för heparin, vilket gör att de träffar på varandra så att
APC-PCI-komplexet kan bildas (Fig. 3; 11).
Men hur kunde det vara möjligt att mäta APC-PCI-
koncentrationen med en metod baserad på två mono-
klonala antikroppar? Såväl zymogenet till APC, Protein
C, som fritt PCI har ju mer än tiotusen gånger högre
plasmakoncentration än APC-PCI-komplexet (2), alltså
samma problem som med trombin-antitrombinkom-
plexet. Om vi t.ex. tar en anti-PCI-monoklonal anti-
kropp som catcher och förutsätter att den har samma
affinitet för fritt, icke kluvet, PCI som för PCI i komplex
med APC så skulle mindre än en tiondels promille av
det PCI som bands till monoklonalen utgöras av APC-
PCI-komplex. Resten vore fritt, icke kluvet PCI. Lika
illa skulle det gå med en monoklonal mot Protein C
som catcher. Men det gick att ta fram en metod för
att mäta APC-PCI-komplexet, dessutom en extremt
känslig metod.
Eftersom vi visste hur serinproteashämmare, som
PCI, fungerar hade vi en chans. Vi insåg att det borde
vara möjligt att ta fram en catcherantikropp mot PCI
som
endast
kände igen PCI i komplex med APC (12).
Som vi redan beskrivit ovan för trombin och antitrom-
bin bildas vid hämningen av proteaset ett kovalent
komplex mellan proteaset och serpinet. Man borde
kunna göra en monoklonal antikropp vars epitop var
belägen på och omkring den insatta peptidkedjan (gul
i Fig. 1). En sådan monoklonal skulle inte ha någon
affinitet för fritt, icke kluvet PCI. Orsaken till att det
borde fungera var att det, till skillnad från hur det
förhöll sig med antitrombin, inte finns ett stort molärt
överskott av fri/kluven, hämmare som är loopinsatt.
Var är epitopen för monoklonalen?
Nästa fråga att lösa var att försöka ta reda på var i den
insatta peptidkedja som epitopen för monoklonalen
M36 var belägen. När man immuniserar möss med
ett kluvet serpin, t.ex. PCI, bildas ett mycket stor
antal antikroppar mot epitoper belägna i olika delar
av molekylen. För oss gällde det att hitta de monoklo-
naler som hade hög affinitet för loopinsatt PCI men
ingen affinitet för den inte loopinsatta formen (Fig. 1).
Epitopen för dessa monoklonaler måste vara belägen
i den insatta gula loopen. För att hitta antikropparna
med de önskade egenskaperna märkte vi loopinsatt
PCI med
125
I. Det märkta, loopinsatta PCI sattes till
en lösning som hade ett stort överskott av omärkt, icke
loopinsatt PCI. Det gjorde att vi
endast
skulle finna de
monoklonaler som var specifika för den loopinsatta,
125
I märkta formen, och inte det sannolikt jättelika
överskott av monklonaler, som band både loopinsatt
och icke loopinsatt PCI. Vi hittade några och den vi
använde som catcher gav vi namnet M36 (12).
En gemensam egenskap hos serpinerna är att de,
liksom andra proteiner, är metastabila – sätter man
till guanidinhydroklorid, så denatureras serpinet när
koncentrationen nått 2 till 3M, så även PCI. Om vi gör
samma försök med loopinsatt PCI så denatureras det
inte ens vid maximal guanidinhydrokoridkoncentra-
tion, d.v.s. 6M (Fig. 4). Loopinsatta serpiner är således
exceptionellt stabila (12).
Fig. 3.
Heparinmedierad inaktivering av APC. (A) APC överst
(blått) och PCI underst (huvudsakligen rött) rör sig, tack vare
affiniteten för heparin (gult) mot varandra. (B) När de möts
bildas ett komplex och APC slungas ner till under PCI och
denatureras som visas i Fig. 1
2
.
