30 |
Klinisk Biokemi i Norden · 3 2013
Men man kan göra serpinet stabilt utan att klyva det
med ett proteas. Man kan till exempel syntetisera pep-
tiden P1 till P14 och försöka sätta in den i PCI. Hundra
gångers molärt överskott av peptiden kan inkuberas
med PCI vid 37° C över natt. Om alfaaminogruppen
i peptidens aminoterminala aminosyra är acetylerad
så blir peptiden inkorporerad i en ”pleated sheet”, som
visas i Fig. 1 och 4. Men om man gör om försöket och
sätter till samma överskott av peptiden, men nu utan
att först ha acetylerat alfaaminogruppen, så blir inte
peptiden insatt i ”pleated sheeten”. Acetyleringen av
den aminoterminala aminosyran får den syntetiska
peptiden att likna den peptid som normalt sätts in i
betasheeten när hämmaren klyvs och bildar komplex
med ett proteas (Se högra delen av Fig. 1 och Fig. 5).
Om vi tittar på Fig. 5 så ser vi vad som händer om vi
byter ut t.ex. aminosyra P6, P9 eller P13 i peptiden vi
satt in i humant PCI. De tre aminosyrornas sidokedjor
pekar utåt, viket är en förutsättning för att peptiden
ska sättas in. Om vi byter ut aminosyrorna P6 och
P9 påverkas inte bindningen till den monoklonala
antikroppen nämnvärt. Om vi däremot byter ut Arg i
position P13 till Thr minskar bindningen av antikrop-
pen kraftigt, vilket visar att epitopen för antikroppen
är belägen i anslutning till P13 (12) (Fig. 5).
Den nya analysen
Nu kunde vi göra en sandwichanalys för att mäta APC-
PCI-komplexets plasmakoncentration. Som catcher-
antikropp hade vi förstås vår anti-PCI monoklonal
M36, som var specifik för den loopinsatta formen av
PCI, medan vår reporterantikropp var mot Protein
C, HPC4. Vi fastnade för att använda den så kallade
DELFIA-metoden, som utvecklats av det finländska
företaget Wallac (13).
Vi använde streptavidinklädda mikrotiterplattor
tillsamman med vår biotinylerade catcherantikropp
(M36), den som är specifik för loopinsatt PCI. Efter
att proven tillsats och inkubationen pågått i en timme
sköljdes plattan och vår Eu
3+
märkta reporterantikropp
mot protein C (HPC4) tillsattes. Efter ytterligare en
inkubering och sköljning avlästes fluorescensen. Wal-
lacs metod är unik och bygger på mätning av fluores-
censen från Eu
3+
märkta reporterantikroppar. En milli-
sekund efter excitationen mäts fluorescensen. Fördelen
med det är att i stort sett all bakgrundsfluorescens då
redan har klingat av. Ett tecken på att metoden skulle
fungera bra var att standardkurvan, tack vare de två
antikropparnas höga affinitet för loopinsatt PCI res-
pektive Protein C, var helt linjär (13).
Metoden visar sig vara exceptionellt känslig
Att APC-PCI-metoden är exceptionellt känslig visade
sig när vi börja använda den för att undersöka om
blodkoagulationen är aktiverad hos patienter med
aortaaneurysm.
Aneurysm är ett påtagligt kliniskt problem då
cirka fyra procent av män som är 65 år gamla eller
äldre har aortaaneurysm. Det är allvarligt då ruptur
av aortaaneurysm är en vanlig orsak till plötslig död
hos denna grupp. Hos kvinnor är aortaneurysm långt
mindre vanligt.
Den etablerade metoden för att upptäcka aorta-
aneurysm är att använda ultraljud. Metoden började
användas i Lund redan på femtiotalet. Fysiologen Inge
Fig. 4.
Denaturering av PCI
som en funktion av koncentra-
tionen av guanidinhydroklorid.
Denatureringen är mätt som
fluorescensemission. Av figuren
framgår att nativt PC denatu-
reras vid 2-3 M guanidinhydro-
klorid liksom PCI som inku-
berats med icke N-acetylerad
peptid medan kluvet PCI liksom
PCI inkuberat med N-acetylerad
aminoterminal aminosyra lik-
som PCI inkuberat N-acetylerad
aminoterminal aminosyra med
Arg P13 muterad till Thr
3
.
