![]()
12
| 4 | 2005
Klinisk Biokemi i Norden
API 3000 är känsligheten 20 pmol/L. I båda fallen
injiceras en volym som motsvarar 5
μ
L ursprungligt
prov.
17
α
-hydroxyprogesteron
Det viktigaste användningsområdet för bestäm-
ning av 17
α
-hydroxyprogesteron är diagnostik av
CAH och bestämningen är en del i screeningpro-
gram för nyfödda. I immunologiska metoder ger
störande faktorer ofta felaktigt förhöjda resultat.
Hos nyfödda barn förekommer flera olika sulfate-
rade progesteronmetaboliter, som korsreagerar med
flera antikroppar
(26)
. Extraktion eller kromatografi
före den immunologiska bestämningen är därför
nödvändig speciellt för prov från nyfödda. Vi gjorde
bestämningarna med hjälp av vätske-extraktion,
kromatografi på Lipidex 5000 och RIA. Denna
teknik fungerar väl men är långsam (3 arbetsda-
gar), känsligheten är otillräcklig och kalibreringen
av kolonnerna är problematisk
(27)
. Det har därför
funnits behov av en snabbare och mera specifik
metod.
Vi bestämmer numera 17
α
-hydroxyprogesteron
rutinmässigt med LC-MS/MS (13). Serum extraheras
med dietyleter och som intern standard används
deutererat 17
α
-hydroxyprogesteron. I ESI joniseras
17
α
-hydroxyprogesteron och bildar jonen (M-H)+,
331 som sönderfaller till fragmenten 97 och 109,
som båda kan användas för kvantitering. Som elue-
ringsbuffert i kromatografin lämpar sig en metanol-
vattengradient och ammoniumacetat kan anvädas
för att öka produktionen av (M-H)+ joner. Med en
total körtid på 10 minuter i en RP kolonn uppnås
god separation och 17
α
-hydroxyprogesteron elu-
eras vid 5-6 minuter. Största delen av förorening-
arna elueras före själva analyten. Reproducibiliteten
mellan körningarna är 8-9%. Metodens känslighet
är 200 pmol/L med API 2000.
Testosteron
Testosteronnivåerna i serum hos barn och kvinnor
kan inte mätas tillförlitligt med automatiska immu-
nologiska metoder (6, 28) och det är även problem
med diagnostik av hypogonadism hos män (6).
Nivåskillnaderna mellan olika metoder är så stora
att man inte kan skilja åt eugonadala från hypogo-
nadala män om man ej använder metodspecifika
referensvärden. Koncentrationen av fritt testosteron
på basen av totaltestosteron, SHBG och albumin
beräknas i många laboratorier och detta förutsätter
en väl fungerande testosteronbestämning.
I vår masspektrometriska rutinmetod extraheras
testosteron med eter-etylacetat och separeras med
RP kromatografi med en 10-minuters vatten-meta-
nolgradient. Testosteron fragmenteras med ESI till
en positivt laddad jon (M-H)+ 289 ---> 91. Med
API 2000 och en provvolym på 25
μ
L är den lägsta
mätbara koncentrationen 100 pmol/L och med API
3000 30 pmol/L.
Konklusion
LC-MS/MS har visat sig vara en specifik, käns-
lig och tillförlitlig teknik för bestämning av ett
flertal olika steroider. Metoden lämpar sig bra för
daglig rutin och har många fördelar jämfört med
direkta immunologiska metoder. Typiska analytiska
problem förorsakade av interferens med bärarpro-
teiner och korsreagerande substanser elimineras.
Immunkemiska metoder med extraktion är ännu
brukbara, men LC-MS/MS är snabbare och minskar
markant behovet av manuellt arbete. Vår linje är
därför att göra det flesta steroidanalyserna med
LC-MS/MS. Det främsta undantaget är estradiol,
men lyckligtvis finns det ett fåtal tillräckligt käns-
liga och specifika immunonlogiska metoder för
denna analyt. LC-MS/MS är ett dyrare alternativ
än automatiska immunologiska metoder, men våra
kliniker är villiga att betala för bättre kvalitet. En
orsak till att vi började utveckla bättre metoder
var att en endokrinolog påpekade, att ett felaktigt
förhöjt värde för kortisol i urin ofta ger upphov till
utredningar, som kostar 10-100-falt mer än korti-
solbestämningen.
Antalet steroidbestämningar för diagnostiska behov
är begränsat. Förutom estradiolbestämningarna i
samband med fertilitetsbehandlingen är steroidana-
lytiken vanligtvis icke-akut. Enligt vår uppfattning
bör man på nationell nivå överväga att koncentrera
många steroidbestämningar till laboratorier, som
utför analyserna med tillförlitliga metoder.
Litteraturförteckning
1. Kinter M. Towards broader inclusion of liquid
chromatography – mass spectrometry in the
clinical laboratory, Editorial, Clin Chem , 2004:
50;1500-1.
(Fortsat fra side 10)
