38 |
Klinisk Biokemi i Norden · 2 2019
Metodens specificitet för isoenzymet CK-MM bidrar
till att minska mängden felaktiga positiva screenin-
gresultat. Metoden kan dessutom även mäta CK-MM-
molekyler som mist sin enzymatiska aktivitet, vilket
innebär att resultaten från metoden störs mindre av
inaktiveringen av kreatinkinas i proven. Kalibreringen
i analysen har skapats så att t.ex. variationen mellan
olika produktionsomgångar har minimerats, vilket gör
att metoden gör det möjligt att jämföra resultaten från
olika laboratorier. I den här artikeln beskrivs de tester
som utförts för att säkerställa metodens analytiska och
kliniska funktion.
Material och metoder
Reagenskitet GSP Neonatal Creatine Kinase-MM
(3311-0010) som utvecklas av PerkinElmer (Wallac
Oy, Åbo) innehåller alla nödvändiga reagenser som
GSP-instrumentet behöver för att köra en analys, med
undantag för de separat sålda lösningarna GSP Wash
Concentrate (4080-0010) och DELFIA Inducer (3304-
0010). Reagenskitet innehåller kalibratorer i form av
blodprov (CK-MM Calibrators, 6 nivåer), kontrol-
ler i form av blodprov (CK-MM Controls, 3 nivåer),
analysbuffert (CK-MM Assay Buffer) samt en CK-
MM-specifik monoklonal mus-antikropp märkt med
ett europiumkelat (Anti-CK-MM-Eu Tracer) och en
mikrotiterplatta bekläddmed CK-MM-specifik mono-
klonal antikropp (Anti-CK-MMMicrotitration strips).
Analyskörningen påbörjas genom att 3,2 mm stora
blodfläckar klipps ut från kalibrator-, kontroll- och
provkorten i mikrotiterplattans brunnar. Plattan för-
flyttas till GSP-apparaten, somdoserar analysbufferten
och denmärkta antikroppen i plattans brunnar. Under
en fyra timmar lång intervallskakning-inkubation i
25 °C extraheras CK-MM från blodprovet och binds
till märk- och plattantikropparna. Därefter tas blod-
fläckarna ut ur brunnarna och brunnarna tvättas sex
gånger med en tvättlösning. Slutligen tillsätts DEL-
FIA Inducer-lösning i brunnarna för att disassociera
europiumet från den märkta antikroppen och bilda
fluorescerande kelater. Europiumfluorescensen mäts
tidsupplöst och CK-MM-halten i provet är direkt jäm-
förbar med den uppmätta fluorescenssignalen.
För att testa GSP CK-MM-metodens analytiska
prestanda framställdes olika blodprov från frivilliga
vuxna hos vilka mängden endogen CK-MM varie-
rar mellan 20–90 ng/ml. Blodprovens hematokrit
justerades så att den motsvarade den hos nyfödda
(35-65 % [6]) före appliceringen på blodprovskort.
En del av proven spetsades med ren CK-MM från
människa (Lee Biosolutions, produktnummer #190-26)
för att uppnå höga CK-MM-halter. Mycket låga prov
framställdes på motsvarande sätt genom att separera
röda blodkroppar och suspendera dem i en 0,9 %NaCl,
120 g/l sackaroslösning, eftersom endogen CK-MM
lokaliserats i blodets plasma.
Metodens analytiska specificitet för CK-MM-iso-
enzym analyserades genom att framställa blodprov
som var spetsade till en känd halt antingen med ren
CK-MM från människa, ren CK-MB från människa
(Lee Biosolutions, produktnummer #190-25) eller ren
CK-BB frånmänniska (Lee Biosolutions, produktnum-
mer #191-25), samt genom att mäta varje prov med tolv
parallella prover i en körning.
Metodens analytiska känslighet bestämdes i enlighet
med riktlinjen EP17-A2 från Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) [7]. Där fastställs de storhe-
ter som beskriver analytisk känslighet: Limit of Blank
(LoB), Limit of Detection (LoD) och Limit of Quanti-
tation (LoQ). För att bestämma LoB framställdes fem
CK-MM-fria blodprov och för att bestämma LoD samt
LoQ framställdes åtta blodprov med låg CK-MM-halt
(mellan 1,5–14 ng/ml). Dessa prov mättes i totalt 15
körningar uppdelade på tre olika GSP-instrument och
tre olika användare. Körningarna gjordes under fem
arbetsdagar med tre olika reagenskit. I varje körning
mättes LoB-, LoD- och LoQ-proven med sex parallella
prov vardera.
GSP CK-MM-analysens analytiska repeterbarhet
bestämdes i enlighet med CLSI:s riktlinje EP05-A3 [8].
För detta framställdes tio olika blodprov med en CK-
MM-halt mellan 22,7–7471 ng/ml. För att bestämma
den interna spridningen i laboratoriet mättes proven
av två användare genom att köra två plattor (varje
prov hade två replikat/platta) per dag i totalt 20 dagar
med ett GSP-instrument och en uppsättning reagen-
ser. Spridningen mellan uppsättningarna reagenser
bestämdes av två användare genom att köra tre plattor
(varje platta från olika uppsättningar reagenser, varje
prov hade fem replikat/platta) per dag i totalt femdagar
med en GSP-instrument. Spridningen mellan GSP-
instrumenten bestämdes av två användare genom att
köra tre plattor (varje platta i olika GSP-instrument,
varje prov hade fem replikat/platta) per dag i totalt fem
dagar med en uppsättning reagenser.
Metodens analytiska linjäritet bestämdes i enlighet
med CLSI:s riktlinje EP06-A [9]. Två olika provserier
framställdes för detta. Den första serien omfattade
