Polymerase krede reaktionen- Polymerase
ChainReaction (PCR)
ANNECHARLOTTE JÄGER OG FINNCILIUS NIELSEN
Klinisk Biokemisk afdeling, Rigshospitalet, DK-2100 K!llbenhavn
0,
Danmark
I Carl Djerassis
"science in fiction"
roman
"The
Bourbaki Gambit"
ml/ldes fire :eldre videnskabs–
m:end, for under synonym at publicere et i s:er–
klasse opsigtsv:ekkende projekt, for at bevise det
videnskahelige samfund uretm:essigt tilsides:etter
:eldre forskere. Efter at have vurderet forskellige
projektmuligheder kommer en af dem på f!lllgen–
de ide:
"Let us denature a double-stranded target
DNA, anneal syntheticprimers to the terminal se–
quence flanking the target DNA sequence ofeach
strand, andadd sameDNA polymerase.......A new
DNA strand will be produced, beginning at the
primer terminus, and extending across the entire
target sequence.......Ifyou do this
n
times, youget
2"
times as much target.
Det var dette princip -
"polymerase chain reaction" (PCR) - som Karry
Mullis og hans kolleger fraCetusCorporation f!llr–
ste gang beskrev i 1987, og Mullis fik Nobelpri–
sen for allerede i 1993
(1
,2). Det er ikke tilf:eldigt
at Carl Djerassi netop lader sine hovedpersoner
"opfinde"PCR, for der er n:eppe nogen anden tek–
nologi, der med samme kraft har sneget sig ind i
stort set al biologisk forskning. PCR gl/lr det, på en
enkel og billig måde, muligt at producere store
m:engder afet givent stykkeDNA,ogdetteer cen–
tralt for al molekyl:erbiologisk arbejde. På trods
af det enkle koncept rummer PCR teknikken
mange finesser. Denne artikel vii beskrive prin–
cippet og forskellige anvendelser af PCRmed re–
levans for klinisk biokemi.
Polymerase krede reaktionen
Figurl viser princippet ienalmindeligPCR. DNA
blanctes med syntetiske oligonukleotid primere,
deoxynukleotider og enDNA polymerase.
I
f!llrste
runde opvarmes DNA til 95 °C så de to strenge
skilles ad. Herefter s:enkes temperaturen, så pri–
meme kan binde sig til DNA og polymeriseringen
Klinisk Kemi
i
Norden 2. 1997
af de to nye strenge kan begynde. Nårdetteer af–
sluttet gentages proceduren, hvorved antailet af
kopier fordobles i hver runde.
I
det oprindelige
design benyttedeman almindeligKlenow polyme–
rase. Dette var imidlertid forbundet med en r:ekke
vanskeligheder, daenzymeter varmelabilt ogmåtte
tils:ettes efter hver denaturering. Desuden var det
vanskeligt at opnå en h!llj specificitet ved binding–
en af primerne, da temperaturen skulle holdes
omkring 37
oc.
Den generelle anvendelighed af
PCR blevderfor dramatisk
!Il
get, da den labileKle–
now polymerase blev erstattetmedden termostab–
ile Taq-polymerase (3).
Taq
stammer fra bakterien
Thermus Aquaticus,
der lever i varmekilder, og
enzymet tålerkonstant opvarmning
til
95
oc
i l:eng–
ere tid. Enzymet har maksimal aktivitet fra 70-80
°C, og en PCR runde deles derfor normalt op i tre
dele: l)
Denaturering
ved 95
oc
i
l
min; 2)
An–
nealing
hvor temperaturen s:enkes til ca. 50-60
o
c
i l min, så primeme kan binde sig til DNA temp–
laten; 3)
Extension
ved
72
oc
i
2
min. Antailet af
eyeler s:ettes til 30-35, daTaq polymerasen er op–
brugt ved dette cyclustal. Ved en effektiv reaktion
kan man opnå en amplifikation på lxl0
6 ,
altså ca.
l!Jg
DNA-produkt fra
10·
6
!Jg
DNA-template. Dette
er mere end tilstr:ekkeligt til de fleste rekombi–
nante DNA-teknikker - f.eks. sekventering, klo–
ning eller gel-analyser.
Selvom PCR i teorien er umådelig simpel, er
det velkendt, at teknikken er lunefuld. De tre vig–
tigste parametre, der er bestemmende for en spe–
cifik reaktion, er primerdesignet, annealing-tem–
peraturen og magnesiumkoncentrationen (4,5).
Normalt benytterman primere på 18-22 nukleoti–
der. Er primeme kortere, går det ud over specifici–
teten, og er de l:engere, giver det ofte probierner
med dimerisering af primeme under reaktionen.
Annealing-temperaturen af en primer anslås ved
53
