Klinisk Biokemi i Norden Nr 4, vol. 17, 2005 - page 6

9
| 4 | 2005
Klinisk Biokemi i Norden
strofalt dåliga kvalitet inte uppdagats. Resultaten
i externa kvalitetsstudier visar att resultatnivån
mellan olika metoder kan variera otillåtligt mycket,
t.o.m. fem och tiofalt. Manuella RIA-metoder ger
ofta bättre resultat, men eftersom efterfrågan på
sådana metoder minskat har diagnostikindustrin
inte kunnat upprätthålla välfungerande manuella
RIA-metoder med extraktion. Som en följd av detta
har kvaliteten på de gamla metoderna sjunkit.
Uppenbarligen har vi oss själva att skylla för denna
utveckling – vi har okritiskt anammat automatiska
metoder fastän vi borde ha noterat försämringen i
kvalitet.
För steroidanalytik erbjuder LC-MS/MS uppenbar
analytiska fördelar jämfört med immunologiska
metoder och i kombination med isotoputspädning
(ID-MS) används den som referensmetod. Man
undviker problem förorsakade av ospecifika anti-
kroppar, bindarproteiner, matrixeffekter och andra
störande faktorer såsom läkemedel och variande
reagenskvalitet. Även i immunologiska metoder kan
man undvika dessa problem genom att använda
extraktion och kromatografisk rening före, men
samtidigt ökar variationen. Även om LC-MS/MS
kräver extraktion av provet, är metoden ekonomiskt
fördelaktigare samtidigt som den är analytiskt över-
lägsen och mindre krävande tekniskt. Det är lätt
att uppnå en hög provhanteringskapacitet därför
att förbehandlingen kan göras i stora serier. HPLC-
apparaten är försedd med en automatisk provma-
tare och körtiderna för kromatografin är korta (2-10
min). Kombinationen av den höga specificiteten
i MS/MS med HPLC:ns höga separationsförmåga,
gör det möjligt att nå mycket hög specificitet och
känslighet. Därför är bestämning av kliniskt vik-
tiga steroider med LC-MS/MS i många hänseenden
en konkurrenskraftig teknik. LC-MS är visserligen
dyrare än analys med en automatiska immunalay-
sator, men i de fall där dessa inte ger tillförlitliga
resultat bör man inte använda dem. Att göra det är
i vårt tycke jämförbart med kvacksalveri, och det
skall vi inte syssla med.
LC-tandem masspektrometerns funktion
Jonisation med elektrospray (ESI) har spelat en
central roll för utvecklingen av masspektrometrin.
Molekylerna i provet försätts i ett laddat tillstånd,
vilket gör det möjligt att separera dem i masspektro-
metern, som vanligen kopplas till en högupplösande
vätskekromatograf (HPLC). Det finns många olika
typer av masspektrometrar, t.ex. kvadrupol, jonfäl-
la, hybrid-kvadrupol-TOF, FT-IRC och MALDI-TOF.
För analys av steroider används vanligen en HPLC
anluten till en kvadrupolmaskin (bild 1, princip).
Bestämning av kliniskt viktiga steroider med
LC-MS/MS
Masspektrometriska metoder har utvecklats för
de flesta kliniskt viktiga steroiderna i serum och
urin, såsom testosteron, 5
α
-dihydrotestosteron och
androstendion
(3-8)
, kortikosteroider såsom kortisol,
kortison, 17
α
-hydoxyprogesteron och 11-deoksi-
kortisol
(9-16)
, mineralokortikoiden aldosteron
(17)
,
estrogener (estradiol, estron), progesteron
(18-19)
och olika steroidmetaboliter
(20-23)
. LC-MS/MS har
används också för screening av kongenital binjure-
hyperplasi (CAH) hos nyfödda. Genom samtidig
bestämning av 17
α
-hydroxyprogesteron, kortisol
och androstendion ur ett kapillärblodprov kan man
avsevärt förbättra screeningresultatens specificitet
(24)
.
Kortisol, 17
α
-hydroxyprogesteron och testoste-
ron kan lätt bestämmas med LC-MS/MS. Dessa ste-
roider joniseras bra med ESI och producerar minst
ett fragment, som kan användas för kvantitering.
Med ESI kan man jonisera neutrala föreningar om
man tillsätter t.ex. ammoniumacetat i eluenten då
föreningens protonaffinitet är större än den för
ammoniak. Vid fragmentering av testosteron och
17
α
-hydroxyprogesteron bildas positivt laddade
(Fortsætter side 10)
Principen på en LC-MS/MS. Den övre bilden är en HPLC-
apparat, där detektorn är ersatt med en masspektrometer.
1,2,3,4,5 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,...36
Powered by FlippingBook